GV3101（pSoup-p19）Chemically Competent Cell  根癌(熱激)感受態細胞

基因型：

C58 (rifR) Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) ( gentR)Nopaline(pSoup-p19-tetR)

簡要說明：

p19蛋白來源于番茄叢矮病毒，可抑制宿主對外源基因的RNA沉默效應，提高異源基因轉錄本的穩定性，進而促進異源蛋白的表達，廣泛應用于轉基因植物及煙草葉片，擬南芥葉片，番茄葉片或原生質體的瞬時表達系統中。GV3101菌株為C58型背景，核基因中含有篩選標簽——li福平抗性基因rif，為了便于轉化操作，此菌株攜帶一無自身轉運功能的胭脂堿型Ti質粒pMP90 (pTiC58DT-DNA)，此質粒含有vir基因 (vir基因是TDNA插入植物基因組必需的元件，pMP90 (pTiC58DT-DNA)質粒自身的T-DNA轉移功能被破壞，但可以幫助轉入的雙元載體T-DNA順利轉移)。pMP90 (pTiC58DT-DNA)型Ti 質粒含有篩選標簽：gent，賦予GV3101菌株qing大霉素抗性；在GV3101菌株中轉入help質粒：pSoup-p19即為GV3101(pSoup-p19)菌株，可幫助pGreen，62SK，pGs2等質粒在農桿菌中復制，同時賦予該菌株四環素（tet）抗性。適用于擬南芥、煙草、玉米、土豆等植物的轉基因操作GV3101(pSoup-p19)化學轉化感受態細胞經特殊工藝制作，pCAMBIA2301(ka那霉素抗性)質粒檢測轉化效率>103 cfu/μg DNA。

操作說明：

1.取-80℃保存的農桿菌感受態于冰上待其部分融化，處于冰水混合狀態時插入冰中。

2.每100μl感受態加1ug（體積不大于10ul）質粒DNA，用手bo打管底混勻，依次于冰上靜置5分鐘、液氮5分鐘、28℃水浴5分鐘、冰浴5分鐘。

3.加入700μl無抗生素的LB或YEB液體培養基，于28℃振蕩培養2~3小時。

4.6000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養箱培養2-3天（當平板只含有50ug/ml kan 時，28℃培養48h即可；平板中同時加入50ug/ml kan，20ug/ml rif 時，需28℃培養60h；如果使用的平板含有50ug/ml rif 則需要28℃培養72-90h）。

注意事項：

1.加入質粒時體積不應大于感受態體積的1/10 ；質粒不純或存在乙醇等有機物污染，轉化效率急劇下降；質粒增大一倍，轉化效率下降一個數量級。

2.混入質粒時應輕柔操作。

3.轉化高濃度的質粒可相應減少最終用于涂板的菌量。

4.LI福平濃度不應高于25ug/ul，過高的LI福平濃度不利于農桿菌生長，會降低其生長速度和轉化效率。本公司感受態計算轉化效率時所用平板只含有50ug/ml kan，若所用平板含有20ug/ml rif則轉化效率降低到1/2。

5.培養基中加入LI福平的目的是防止雜菌生長、篩選農桿菌；根據所用菌株抗性加入LIAN霉素或QING大霉素可防止Ti質粒丟失，但LIAN霉素不利于農桿菌的轉基因操作，所以一般培養農桿菌時不考慮LIAN霉素或QING大霉素，Ti質粒丟失的概率極低（可以忽略）。